|
|
Molekulárně-biologická diagnostika lidských polyomavirů
Ryšavá, Markéta
S lidskými polyomaviry se většina lidské populace setká v dětství, kdy je první infekce bezpříznaková či s mírnými symptomy. Tyto viry ovšem v lidském těle perzistují a reaktivují se nejčastěji při imunosupresi. S reaktivací JC viru je spojena progresivní multifokální encefalopatie. S BK virem je spojena hemoragická cystitida, která má za následek ztrátu aloštěpu při transplantaci ledviny. Přesnou diagnostikou lze viry včas detekovat a zmírnit poškození tkáně. Tato diplomová práce se zabývá biotechnologiemi, které lze při detekci virů využít se zaměřením na real-time PCR, která je v diagnostice virů zlatým standardem. Literární rešerše shrnuje základní informace o polyomavirech se zaměřením na lidské polyomaviry BKV a JCV. Shrnuje biotechnologické metody používané k detekci polyomavirů, jak v rámci rutinní diagnostiky, tak alternativní přístupy zahrnující biosenzory a CRISPR. Experimentální část práce zahrnuje návrh detekčního systému pro polyomaviry od in silico analýzy genomu, přes návrh potenciálních primerů, po teoretickou analýzu specificity. Praktická část práce pak porovnává účinnost a senzitivitu amplifikace dvou re-akčních směsí, kdy je jedna určena pro jednoduché systémy a druhá pro multiplexy. Dále zahrnuje testování vybraných aditiv PCR a stanovení citlivosti a parametrů validity testu reakční směsi vybrané pro vývoj PCR systému. Výsledky poukázaly, že detekce pomocí multiplex reakční směsi je dostatečně citlivá, jelikož splňuje podmínky a požadavky klinických doporučení a současně vykazuje velmi dobré hodnoty senzitivity a specificity testu srovnatelné s publikovanými technologiemi. Tato reakční směs se jeví jako relevantní k použití vývoje a optimalizaci PCR systému pro detekci polyomavirů.
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
MikroRNA kódované polyomaviry.
Zachovalová, Veronika ; Bruštíková, Kateřina (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
MicroRNA jsou malé regulační molekuly RNA kódované v genomu organismu. Biogeneze mikroRNA probíhá částečně v jádře a částečně v cytoplazmě. Výsledkem je funkční, 22 nt dlouhá molekula mikroRNA. MikroRNA jsou schopné umlčovat geny za pomoci sekvenčně specifické degradace cílové mRNA, nebo za pomoci represe translace cílových, komplementárních mRNA. U savců je běžnější mechanismus represe translace, kdy je mikroRNA neúplně komplementární k 3'UTR cílové mRNA. Polyomaviry jsou malé, neobalené DNA viry s cirkulárním dsDNA genomem a ikosahedrální kapsidou tvořenou pentamerami VP1 proteinu. Tyto viry se řadí mezi tzv. onkogenní viry, neboť mohou přispět k transformaci buněk a rozvoji vážných onemocnění jako je například karcinom Merkelových buněk. Ve svém genomu kódují regulační proteiny nazývané T antigeny, strukturní geny kapsidy, ale také mikroRNA. Právě na mikroRNA kódované genomem SV40, MPyV, MCPyV, BKPyV a JCPyV bude zaměřená tato práce. Klíčová slova: polyomaviry, malé interferující RNA, mikroRNA, siRNA, RNA interference, myší polyomavirus, BK virus, JC virus, SV40
|
|
|
Analýza protilátkové odpovědi u BK virové infekce
Tomanová, Tereza ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
BK virus je lidský polyomavirus s vysokou prevalencí v populaci. Obvykle je pro svého hostitele neškodný, komplikace působí při imunosupresi, často při transplantacích ledvin, jelikož perzistuje v epiteliálních buňkách ledvin. Exis- tují čtyři subtypy BK viru a zdá se, že je důležité identifikovat, na jaký subtyp je dárce a příjemce ledviny pozitivní. Takové určení subtypově specifických pro- tilátek pomocí jednoduchého testu by mohlo pomoci s eliminací komplikací po transplantaci ledvin. Při předchozím výzkumu byl vytvořen návrh ELISA testu, který by mohl sérologicky rozlišit hlavní BK virové subtypy (I a IV), ale jeho vývoj je komplikován tím, že mezi jednotlivými subtypy BK viru a protilátkami dochází ke křížové reaktivitě. Klíčem k úspěchu může být modifikace antigenu používaného pro ELISA test. Proto bylo cílem této diplomové práce zmapovat významná místa kapsidového VP1 proteinu BK viru, konkrétně ve smyčkách EF a DE, která by se mohla podílet na interakci s protilátkami. Toho bylo dosaženo cílenou mutagenezí v genu pro VP1, v oblasti EF smyčky nebo DE smyčky, kde došlo k záměně nukleotidů pro dvě povrchové aminokyseliny, ve kterých se liší sekvence subtypu I a IV. Výsledkem byl gen pro VP1 subtypu IV mutovaný tak, že sekvence v oblasti EF smyčky byla shodná se sekvencí VP1 subtypu I. Stejný...
|
|
|
BK virová infekce u pacientů po transplantaci ledviny.
Girmanová, Eva ; Viklický, Ondřej (vedoucí práce) ; Stříž, Ilja (oponent) ; Krejčí, Karel (oponent)
1 ABSTRAKT BK virus je příčinou vzniku nefropatie asociované s polyomavirovou infekcí (BKVN) u 1- 10 % pacientů po transplantaci ledviny. U 30-80% pacientů po transplantaci ledviny dochází k bezpříznakové reaktivaci BK viru, která nevede k rozvoji BK virové nefropatie. Prvním cílem této studie bylo zavést monitoraci replikace BK viru v krvi a moči u pacientů v prvním roce po transplantaci ledviny. Byly zhodnoceny rizikové faktory a stanoveny hraniční hodnoty viremie a virurie pro rozvoj BKVN. Pozitivní BK virurie >107 kopií/ml a pozitivní BK viremie >104 kopií/ml se vyskytla u 25,8 %, resp. 5 % pacientů. U 3 z monitorovací studie došlo k rozvoji BKVN. Pomocí ROC analýzy byly stanoveny hraniční hodnoty pro rozvoj BKVN na 103 kopií/ml séra pro BK viremii a 6,7x107 kopií/ml moči pro BK virurii. Druhým cílem bylo stanovit expresní profil imunitních genů v biopsiích ledvin ve třech skupinách pacientů s různým stupněm reaktivace BK viru (bez reaktivace viru, s bezpříznakovou virurií, s BKVN). Bylo měřeno 90 genů imunitní odpovědi metodou TaqMan® low density array RT-qPCR. Analýza biopsií od pacientů s bezpříznakovou virurií vedla k identifikaci 5 rozdílně exprimovaných genů (CD3E, CD68, CCR2, ICAM-1, SKI; p<0,05), a funkční analýza ukázala významně zvýšenou přítomnost kostimulačních signálů (CD40 / CD40L;...
|
|
|
Analýza protilátkové odpovědi u BK virové infekce
Tomanová, Tereza ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
BK virus je lidský polyomavirus s vysokou prevalencí v populaci. Obvykle je pro svého hostitele neškodný, komplikace působí při imunosupresi, často při transplantacích ledvin, jelikož perzistuje v epiteliálních buňkách ledvin. Exis- tují čtyři subtypy BK viru a zdá se, že je důležité identifikovat, na jaký subtyp je dárce a příjemce ledviny pozitivní. Takové určení subtypově specifických pro- tilátek pomocí jednoduchého testu by mohlo pomoci s eliminací komplikací po transplantaci ledvin. Při předchozím výzkumu byl vytvořen návrh ELISA testu, který by mohl sérologicky rozlišit hlavní BK virové subtypy (I a IV), ale jeho vývoj je komplikován tím, že mezi jednotlivými subtypy BK viru a protilátkami dochází ke křížové reaktivitě. Klíčem k úspěchu může být modifikace antigenu používaného pro ELISA test. Proto bylo cílem této diplomové práce zmapovat významná místa kapsidového VP1 proteinu BK viru, konkrétně ve smyčkách EF a DE, která by se mohla podílet na interakci s protilátkami. Toho bylo dosaženo cílenou mutagenezí v genu pro VP1, v oblasti EF smyčky nebo DE smyčky, kde došlo k záměně nukleotidů pro dvě povrchové aminokyseliny, ve kterých se liší sekvence subtypu I a IV. Výsledkem byl gen pro VP1 subtypu IV mutovaný tak, že sekvence v oblasti EF smyčky byla shodná se sekvencí VP1 subtypu I. Stejný...
|
|
| |
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Preparation of Monoclonal Antibodies Against VP2 Protein of Human Polyomaviruses
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Růžičková, Šárka (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit dva proteinové antigeny a dvě monoklonální protilátky, založené na minoritním proteinu VP2 lidských polyomavirů BK viru a Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Proběhla příprava monoklonální protilátky proti unikátní části proteinu VP2 BK viru (N-koncový epitop, který se nenachází u proteinu VP3). Buněčná linie produkující protilátku s touto specificitou nebyla zatím nikdy ustavena kvůli nízké imunogenicitě tohoto epitopu. Náš přístup byl z hlediska imunizace myší úspěšný, ale později v průběhu přípravy nastaly vážné problémy se stabilitou hybridomové linie. Dalším cílem této práce byla příprava monoklonální protilátky cílené na sekvenci proteinu VP2 Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Imunizace myší a hybridomová fúze byly provedeny úspěšně. Po čtyřech kolech klonování za účelem přípravy ustaveného klonu bylo devět klonů vybráno k rozpěstování. Rozpěstování pravděpodobně vedlo ke snížení specificity protilátky a ke ztrátě produkce u většiny hybridomů. Jednou zopakované klonování by mělo vyústit v získání ustaveného klonu s dostatečnou produkcí. Příprava dvou proteinových antigenů byla provedena ve dvou expresních systémech. DNA kódující VP2 protein BK viru zkrácený na C-konci a fúzovaný s His-tagem byla klonována do vektoru vhodného pro expresi v...
|
|
|
Analýza životního cyklu BK viru
Bakardjieva - Mihaylova, Violeta ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Mindlová, Martina (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry, jejichž replikace probíhá v buněčném jádře. I přes svoji malou genomovou velikost mohou tyto viry způsobit výrazné změny v hostitelské buňce, jednou z nejvýznamnějších je nádorová transformace. Většina studií lidských patogenů z této čeledi je středem zájmu klinických výzkumů, které však neposkytují dostatek informací o jednotlivých událostech životního cyklu virů. Tato práce se hlavně zabývá přesným určením doby kdy dochází ke vzniku jednotlivých virových produktů a vytvořením časového sledu událostí během infekce v přirozených buňkách, které jsou cílem pro BKV v lidském organizmu. Bylo zjištěno, že časový průběh životní cyklus BKV se velice podobá těm pro modelové polyomaviry MPyV a SV40 a v permisivních buňkách trvá přibližně 40 - 50 hodin.
|
host ::
RSS.